DIVERSITÀ DEL GENOMA CLOROPLASTICO IN CYNARA SVELATA DAL SEQUENZIAMENTO NGS (NEXT GENERATION SEQUENCING)

Lo sviluppo delle tecnologie Next Generation Sequencing (NGS) negli ultimi anni sta consentendo la produzione di grandi volumi di dati di sequenza a costi sempre minori e sta ridimensionando man mano la lunghezza dei passi della ricerca scientifica. Nell"ambito di un progetto di sequenziamento parziale del genoma nucleare di carciofo [Cynara cardunculus L. var. scolymus (L.) Fiori] mediante tecnologia Illumina, sono state ottenute oltre 33 milioni di sequenze paired-end da 75 pb, rappresentando una copertura di circa 2.3x del genoma totale di carciofo. Questa grande quantità di dati ha consentito l"estrapolazione delle sequenze appartenenti al genoma cloroplastico presenti come "contaminanti" tra le sequenze del genoma nucleare. A tal fine tutte le sequenze ottenute dal sequenziamento sono state utilizzate per l"allineamento contro il genoma cloroplastico di Lactuca sativa, per un assemblaggio su genoma di riferimento. In totale, sono state mappate ed assemblate 1.3 M di sequenze, corrispondenti al 3.92% delle reads. È stato così possibile ottenere la sequenza completa del genoma cloroplastico di carciofo, che presentava cinque gap, i quali sono stati facilmente colmati tramite sequenziamento Sanger. In questo modo è stato ottenuto il genoma cloroplastico di riferimento per il genere Cynara. Al fine di valutare la diversità del genoma cloroplastico nella specie C. cardunculus e nel genere Cynara, sono stati amplificati e sequenziati i genomi cloroplastici di 20 altri genotipi. Questi comprendevano sette carciofi appartenenti ai principali gruppi morfoagronomici, due cardi coltivati (C. cardunculus var. altilis DC) e sette cardi selvatici (C. cardunculus L. var. sylvestris Lam.). Sono state incluse nell"esperimento anche altre quattro specie del genere Cynara: C. baetica (Spreng.) Pau, C. humilis L., C. syriaca Boiss e C. cornigera Lindley. Ognuno dei 20 genomi cloroplastici, amplificati tramite Long-Range PCR e marcati singolarmente mediante barcode, è stato sequenziato utilizzando la tecnologia Illumina-Miseq. Il sequenziamento ha prodotto una copertura media di 950x ed ogni genoma cloroplastico è stato assemblato sul genoma di riferimento ottenuto in precedenza. In conclusione, i due diversi approcci sperimentali basati su tecnologie NGS hanno permesso l"ottenimento di 21 sequenze complete di genomi cloroplastici appartenenti al genere Cynara. Questi sono stati utilizzati per studi di genomica comparativa ed hanno portato all"individuazione di marcatori molecolari del tipo SNP, Indel ed SSR, utili per analisi filogenetiche, evolutive ed applicabili alla tracciabilità alimentare dei prodotti derivati del carciofo.