Diagnosi universale e specifica di fitoplasmi in vite, melo ed insetti vettori mediante real time PCR

Flavescenza dorata (FD), legno nero (LN) e scopazzi del melo (AP) sono gravi malattie associate a fitoplasmi (FD, 16Sr-V; BN, 16Sr-XII; AP, 16Sr-X) nella vite (Vitis vinifera) le prime due e nel melo (Malus domestica) la terza (Lee et al., 2000). FD e AP sono considerati organismi da quarantena in Europa e pertanto sono necessari strumenti rapidi e sensibili per la loro diagnosi ed identificazione. A q u esto scopo sono stati messi a punto tre metodi diagnostici specifici per il rilevamento in Real Time PCR di FD, LN e AP e uno per l'identificazione universale di fitoplasmi. Per ogni protocollo diagnostico è stata effettuata un'ottimizzazione utilizzando diverse diluizioni di plasmidi contenenti l'amplicone corrispondente e il DNA totale di isolati di riferimento di fitoplasmi mantenuti in pervinca. La diagnosi è stata poi eseguita sul DNA totale estratto da piante ed insetti vettori raccolti in campo, in anni diversi (dal 2001 al 2004), in areali piemontesi e valdostani. Le analisi gruppo- specifiche sono state effettuate su 209 viti e 20 meli di campo e su 18 adulti di Scaphoideus titanus, 31 di Hyalesthes obsoletus, vettori rispettivamente di FD e LN vite, e 25 di Cacopsylla melanoneura, vettore di AP al melo. La diagnosi universale è stata effettuata su tre campioni di ogni specie già risultati infetti con un titolo elevato, medio e basso di fitoplasma. Sono stati realizzati nuovi primers per la diagnosi di LN ed AP mentre, per rilevare la presenza di FD, inneschi già disponibili (Marzachì et al., 2001) sono stati adattati all'utilizzo in Real Time PCR. La diagnosi universale è stata effettuata con reagenti disegnati per la quantificazione del fitoplasma chrysanthemum yellows (16Sr-I) (Marzachì e Bosco, 2005). Per il rilevamento di FD, LN ed AP è stato utilizzato il colorante SYBR® Green I accoppiato alla curva di melting, mentre per la diagnosi universale una sonda TaqMan. La diagnosi specifica ha rilevato FD con efficienza, rispetto al metodo convenzionale (Marzachì, 2004), del 94% sia su vite che su S. titanus. La diagnosi specifica per LN ha mostrato un'efficienza, rispetto al metodo convenzionale (Marzachì, 2004), del 92% e del 100%, su vite e H. obsoletus, rispettivamente. La diagnosi specifica per AP ha rilevato il patogeno con efficienza, rispetto al metodo convenzionale (Marzachì, 2004), del 100% sia su melo che su C. melanoneura. Nei tre sistemi diagnostici, l'analisi della curva di melting è stata necessaria per valutare la specificità dei prodotti di PCR, quando ottenuti da campioni con bassa concentrazione del patogeno. La diagnosi universale ha rilevato il patogeno con la stessa efficienza dei metodi specifici in tutti i campioni di campo analizzati. La Real Time PCR si è dimostrata un'ottima tecnica per la diagnosi delle fitoplasmosi. L'efficienza diagnostica di tutti i sistemi considerati è risultata pressoché analoga a quella dei diversi metodi convenzionali di diagnosi, tutti caratterizzati da più passaggi (PCR indiretta o PCR/dot-blot) e seguiti da una fase di rilevamento del risultato (elettroforesi, RFLP). I reagenti ottenuti possono essere utilizzati per un approccio quantitativo allo studio delle relazioni tra il fitoplasma, la pianta ospite e l'insetto vettore, come recentemente proposto per AP (Jarausch et al., 2004), onion yellows (Wei et al., 2004), CY (Marzachì e Bosco, 2005) e per fitoplasmi appartenenti a diversi gruppi tassonomici (Christensen et al., 2004).