Biosensore amperometrico per la determinazione dei polifenoli

Nel presente periodo storico, in cui si fa sempre più generale la tendenza all'uso di sostanze naturali, o prodotte secondo tecniche naturali e tradizionali, in campo alimentare, farmaceutico, cosmetico, ecc., gli antiossidanti contenuti negli alimenti assumono un ruolo importante per la loro capacità di ridurre i danni cellulari causati dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS). I polifenoli sono la classe di antiossidanti più abbondante nei costituenti della nostra dieta: sono presenti in frutta, vegetali, cereali, olive, legumi secchi, cioccolato e bevande, come tè, caffè e vino. Sono molecole formate da uno o più anelli benzenici contenenti uno o più gruppi fenolici, facilmente ossidabili a radicali fenossilici secondo il seguente schema semplificato di reazione (Figura 1: Schema di reazione della formazione di radicali fenossilici, in allegato). La delocalizzazione dell'elettrone spaiato nell'anello benzenico conferisce a questi radicali una stabilità tale da rallentare o fermare la catena radicalica della perossidazione lipidica. Risulta quindi evidente l'importanza di studi che permettano di quantificare, in modo semplice e celere, l'azione antiossidante dei polifenoli, soprattutto in alimenti e bevande. Oltre alle metodiche già consolidate, talune messe a punto anche dal nostro gruppo di ricerca, che richiedono però strumentazione adatta, manualità specializzata e congrui tempi di esecuzione, appare interessante l'utilizzo di biosensori per il loro facile utilizzo, i tempi rapidi di risposta e la loro facile automazione. Oggetto del presente lavoro è la messa a punto di un biosensore per la misura delle proprietà antiossidanti di soluzioni contenenti polifenoli. Si tratta della prima fase di un più ampio progetto che ha come obiettivo finale la determinazione dei polifenoli direttamente nella matrice alimentare. Come elemento biologico è stato scelto l'enzima laccasi (laccase from Rhus vernificera - E. C. 1.10.3.2), che catalizza l'ossidazione monoelettronica dei polifenoli. La trasduzione è di tipo amperometrico. La messa a punto del sistema è stata effettuata utilizzando la coppia redox idrochinone/benzochinone: l'idrochinone dapprima viene ossidato enzimaticamente a benzochinone; successivamente il benzochinone viene ridotto ad idrochinone. La conseguente variazione di intensità di corrente elettrica è una misura della quantità di benzochinone ridotto ovvero di idrochinone ossidato. Le prove preliminari, condotte in assenza di enzima, hanno portato alla scelta di diversi importanti fattori: a) il potenziale di lavoro, che deve determinare una riduzione immediata e quantitativa del benzochinone all'elettrodo; b) la molecola "immobilizzatore", che deve avere delle caratteristiche specifiche: deve possedere sufficiente affinità per la superficie elettrodica da legarsi covalentemente all'elettrodo, fornendo un gruppo funzionale adatto alla successiva immobilizzazione dell'enzima, senza interferire con il segnale amperometrico. c) condizioni operative, quali tampone, pH ed elettrolita di supporto. Questo aspetto è particolarmente delicato in quanto è necessario trovare un compromesso tra le condizioni ideali per la reazione enzimatica e quelle necessarie per ottenere un segnale ottimale all'elettrodo. Le migliori condizioni sperimentali sono risultate: tampone sodio acetato, pH 5.0, con sodio nitrato quale elettrolita di supporto; -400 mV; acido 3-mercaptopropionico come immobilizzatore. È stata tentata l'immobilizzazione della laccasi con N-etil-N'-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide idrocloruro (EDC) e N-idrossisuccinimmide (NHS), ma i risultati migliori si sono ottenuti utilizzando chitosano e glutaraldeide. La concentrazione ideale di laccasi per l'immobilizzazione è 10-4 M. In queste condizio